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Jun 05, 2023

C. elegans el envejecimiento es acelerado por uno mismo

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 4381 (2023) Cita este artículo 3815 Accesos 97 Detalles de Altmetric Metrics En C. elegans post-reproductiva, reutilización destructiva de biomasa somática

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4381 (2023) Citar este artículo

3815 Accesos

97 altmétrico

Detalles de métricas

En C. elegans post-reproductiva, la reutilización destructiva de la biomasa somática apoya la producción de yema que, como se demostró recientemente, se ventila y puede servir como alimento para la progenie larvaria. Esto recuerda al esfuerzo reproductivo suicida (muerte reproductiva) típico de organismos semélparos como el salmón del Pacífico. Para explorar la posibilidad de que C. elegans presente muerte reproductiva, hemos comparado pares de especies hermanas de los géneros Caenorhabditis y Pristionchus con hermafroditas y hembras. Informamos que la ventilación de la yema y la patología constitutiva temprana que involucra cambios anatómicos importantes ocurren solo en hermafroditas, que también tienen una vida más corta. Además, sólo en los hermafroditas la eliminación de la línea germinal suprime la patología senescente y aumenta notablemente la esperanza de vida. Esto es consistente con la hipótesis de que C. elegans presenta una muerte reproductiva que se suprime mediante la ablación de la línea germinal. Si es correcto, esto implicaría una diferencia importante en el proceso de envejecimiento entre C. elegans y la mayoría de los organismos superiores, y potencialmente explicaría la plasticidad excepcional en el envejecimiento de C. elegans.

Es probable que los mecanismos del envejecimiento difieran entre organismos con historias de vida semélparas e iteróparas. Las especies semélparas presentan un solo episodio reproductivo, que a menudo implica un grado de esfuerzo reproductivo tan intenso que conduce a una muerte rápida (muerte reproductiva)1,2. Los organismos que exhiben muerte reproductiva semélpara van desde plantas monocárpicas hasta salmón del Pacífico. Por el contrario, las especies iteróparas, que incluyen a la mayoría de los mamíferos, son capaces de realizar múltiples rondas de reproducción y experimentan un proceso de envejecimiento más gradual.

Para ser precisos sobre el significado del término semelparidad: aunque algunos, pero no todos, los organismos con un solo episodio reproductivo exhiben muerte reproductiva, el término semelparidad se usa a menudo para denotar específicamente organismos semelparos que exhiben muerte reproductiva. Concomitantemente, la aparición de muerte reproductiva en organismos con un solo episodio reproductivo es definitiva de semelparidad en el segundo sentido del término.

Desde finales de la década de 1970, el nematodo Caenorhabditis elegans se ha utilizado intensivamente como organismo modelo para intentar comprender las causas del envejecimiento. Esto llevó al descubrimiento de un grado notablemente alto de plasticidad en el envejecimiento en esta especie3,4,5 habiéndose observado aumentos de hasta 10 veces en la esperanza de vida6. C. elegans también es inusual por la gravedad y la aparición singularmente temprana de la patología senescente, que afecta particularmente a los órganos implicados en la reproducción7,8,9,10,11,12. En los hermafroditas de C. elegans post-reproductivos, la biomasa intestinal se convierte en yema, lo que provoca atrofia intestinal y acumulación de yema9,13. Recientemente demostramos que las madres post-reproductivas expulsan yema que puede funcionar como leche (o “leche de yema”), que es consumida por la progenie larval que apoya el crecimiento y la reproducción14.

Este tipo de esfuerzo reproductivo autodestructivo, en el que la reutilización de la biomasa promueve la degeneración de órganos, a menudo ocurre en organismos semélparos que sufren muerte reproductiva. La eliminación de la línea germinal aumenta en gran medida la esperanza de vida tanto en C. elegans como en el salmón del Pacífico, en el último caso al suprimir la muerte reproductiva5,15. En conjunto con su único episodio reproductivo, estas observaciones plantean la posibilidad de que la marcada plasticidad en la esperanza de vida de C. elegans sea una función de la supresión de la muerte reproductiva, es decir, que esta especie sea semélpara.

Otra posibilidad hipotética es que la muerte reproductiva haya evolucionado en C. elegans como consecuencia del hermafroditismo. Las especies de nematodos del género Caenorhabditis son gonocorísticas, con un número aproximadamente igual de hembras y machos, o androdioicas, con hermafroditas autofertilizantes y pocos machos16. El hermafroditismo protándro (en el que primero se producen espermatozoides y luego ovocitos) permite a C. elegans colonizar rápidamente nuevas zonas de alimento, pero a costa de una duración reproductiva más corta debido al agotamiento del propio esperma16,17. La capacidad de convertir biomasa somática en yema para alimentar a la descendencia puede permitir que C. elegans post-reproductiva reduzca este costo y promueva la aptitud inclusiva14. Si es correcto, esto predice que la muerte reproductiva ocurrirá en los hermafroditas de Caenorhabditis pero no en las hembras, donde la reproducción obligada mediante el apareamiento con machos respalda períodos reproductivos más prolongados.

En este estudio utilizamos un enfoque comparativo entre especies para explorar la posibilidad de que la muerte reproductiva ocurra en C. elegans y sea suprimida por la ablación de la línea germinal. El hecho de que C. elegans pueda ser semélparo plantea preguntas interesantes sobre la relevancia de los mecanismos de envejecimiento identificados en esta especie con respecto a los que operan en especies iteróparas (como los humanos).

La ocurrencia de biomasa autodestructiva reutilizada para apoyar la producción de yema para la ventilación en hermafroditas post-reproductivos de C. elegans recuerda a los mecanismos que operan en organismos con muerte reproductiva2. Si es correcta, la hipótesis de que la muerte reproductiva evolucionó después de la aparición de la protandria en el ancestro de C. elegans predice que, entre las especies de Caenorhabditis, la ventilación de la yema ocurrirá en especies androdioicas pero no gonocorísticas. Para probar esto, comparamos tres pares de especies hermanas en este género, donde una es androdioica (A) y la otra gonocorística (G): C. elegans (A) vs C. inopinata (G), C. briggsae (A) vs C. nigoni (G) y C. tropicalis (A) vs C. wallacei (G), respectivamente (Fig. 1a). Estos pares representan tres ocurrencias independientes de la evolución del hermafroditismo a partir de ancestros gonocorísticos18. Para cada par, tanto la ventilación de la yema como la abundante puesta de ovocitos no fertilizados (que actúan como vectores para la yema14) se observaron en hermafroditas pero no en hembras (Fig. 1b, c; Fig. Suplementaria 1a, b). Al igual que en C. elegans, la acumulación de vitelogenina (proteína de la yema) continuó en la vejez a niveles altos en C. briggsae y C. tropicalis hermafroditas, pero no en las hembras de C. inopinata, C. nigoni y C. wallacei (Fig. 1d). También comparamos un par de especies hermanas androdioicas-gonocorísticas del género de nematodos de vida libre Pristionchus y, nuevamente, solo la yema y los ovocitos ventilados anteriormente, y acumularon vitelogenina internamente en la vida posterior (Fig. 1b-d; Fig. complementaria 1a-d). ). Pristionchus demostró carecer de las especies de vitelogenina más grandes correspondientes a YP170 en Caenorhabditis; en cambio, se observó acumulación solo de las especies más pequeñas equivalentes a Caenorhabditis YP115/YP88 (Figuras complementarias 1c, d).

un árbol filogenético que muestra especies hermanas de Caenorhabditis androdioicas y gonocorísticas76. Estimación del tiempo transcurrido desde el origen de la autofecundación en hermafroditas: C. elegans, 0,35–7,2 millones de años; C. briggsae, entre 0,2 y 3,5 millones de años (ref. 77); C. tropicalis, aún desconocida. b La ventilación de la yema está presente en los hermafroditas pero no en las hembras (n = 100 por ensayo). Arriba: YP mayor en el pico de ventilación. Abajo: datos cuantitativos normalizados a yema total en los días 4-6 en C. elegans. M = Marcador. Para ver el gel completo, consulte los datos originales. c Los ovocitos no fertilizados son depositados por hermafroditas, pero no por las hembras (3 ensayos; n = 10 por ensayo). d Mayores niveles internos de YP mayor en Caenorhabditis hermafroditas y P. pacificus hermafroditas. Bandas YP normalizadas a miosina para ajustarse a las diferencias entre especies en el tamaño corporal. ANCOVA unidireccional (n = 10). Para todos los YP internos y la imagen del gel, consulte la figura complementaria 1c, d. b, d Datos de electroforesis en gel de proteínas con tinción coloidal con azul de Coomassie. ser Los animales no están apareados. b,c,d Media ± sem de 3 ensayos y cada punto representa un ensayo. b, c ANOVA unidireccional (corrección de Bonferroni) o prueba t no pareada de dos colas. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,0001, **** p < 0,00001 (valor de p de izquierda a derecha = b: 0,0014, 0,0145, 0,0012, 0,0070; c: 0,0010, 0,0033, 0,0080 , 0,0087; d: 0,0000, 0,0133, 0,0133, 0,0000).

La hipótesis de que la salida de la yema es indicativa de semelparidad, junto con la presencia de salida de la yema en los hermafroditas pero no en las hembras, predice que sólo los primeros exhibirán muerte reproductiva, es decir, que las hembras vivirán más tiempo y mostrarán una patología muy reducida en relación con los hermafroditas. En consonancia con esto, la esperanza de vida fue más larga en las hembras que en los hermafroditas para C. tropicalis (A)/C. wallacei (G) y C. briggsae (A)/C. nigoni (G) pero, como se informó anteriormente19, este no fue el caso para C. elegans (A)/C. par inopinata (G) (Figuras complementarias 2a, b).

Para excluir posibles diferencias entre especies en la susceptibilidad a la infección por la fuente de alimento de E. coli20, la esperanza de vida se midió en presencia de un antibiótico (carbenicilina), y aquí las hembras vivieron más tiempo en los tres pares de especies hermanas (Fig. 2a, b; Suplementario). Figuras 2a, b); Este resultado sugiere que C. inopinata es hipersusceptible a la infección bacteriana, tal vez reflejando su entorno natural distinto (siconia de las higueras). La temperatura de cultivo óptima para C. inopinata es más alta (25–29 °C) que la de C. elegans (20–22 °C)21, lo que plantea la posibilidad de que el cultivo de C. inopinata a una temperatura subóptima baja de 20 °C podría causar una tasa de vida desproporcionadamente baja, aumentando así la esperanza de vida en relación con C. elegans; sin embargo, C. inopinata también vivió más que C. elegans a 25 ° C (Fig. Suplementaria 2c), lo que argumenta en contra de esta posibilidad. De manera similar, en el par de especies hermanas de Pristionchus, los hermafroditas tuvieron una vida más corta (Fig. 2a, Fig. Suplementaria 2a, b), lo que coincide con un informe previo de mayor longevidad en las hembras de Pristionchus22.

a Las hembras viven más que las especies hermanas hermafroditas (no apareadas, con antibióticos). Media ± sem de 3 ensayos. Prueba de rango logarítmico (Mantel-Cox). b Las C. inopinata hembra viven más que las C. elegans cuando se previene la infección bacteriana mediante un antibiótico (carbenicilina) (esta figura; datos combinados de 3 ensayos; n = 100 por ensayo) o irradiación UV de E. coli (Figura complementaria .2d). a, b Para obtener detalles estadísticos, consulte la Tabla complementaria 1, y para conocer la vida útil bruta, los datos consulte el Archivo de datos de origen. c La atrofia intestinal es constitutiva en los hermafroditas y inducida por el apareamiento en las hembras. Media ± sem de 3 ensayos (n = 10 por ensayo por punto temporal). ANCOVA unidireccional con puntuación normalizada a d1 para determinar el cambio en el porcentaje de masa intestinal. Los términos del ensayo no fueron estadísticamente significativos en todas las patologías y, por lo tanto, el ensayo no se consideró una variable adicional. Para obtener detalles sobre las pruebas estadísticas, consulte la sección de métodos. Para la medición de patologías, comparaciones estadísticas entre especies y tratamientos, e imágenes representativas de las patologías utilizadas para la puntuación, consulte la Figura complementaria 4. d Las patologías asociadas a la muerte reproductiva son constitutivas en los hermafroditas y se inducen en las hembras mediante el apareamiento. El mapa de calor compara las diferencias en la progresión de la patología entre especies y tratamientos transformando los gradientes calculados a partir de las mediciones de patología a lo largo del tiempo en puntuaciones Z (consulte las figuras complementarias 4a, d; 3 ensayos, donde n = 10 por punto de tiempo por ensayo, con 5 tiempos apunta hasta el d14, cuando la patología alcanza su punto máximo para C. elegans). Esto permite la comparación entre diferentes patologías normalizando los niveles de una patología determinada con el nivel promedio de esa patología en el grupo (representado por una puntuación Z de 0, con una puntuación Z de +2 que representa la gravedad máxima de la patología en el grupo y −2 los animales más sanos). La agrupación jerárquica se basa en distancias euclidianas por pares. e Atrofia intestinal (azul) y acumulación de charco vitelino (amarillo) en C. elegans envejecido, pero no en C. inopinata (d14, sin aparear). Imágenes representativas de Nomarski. Escala 25 micras. f Degeneración severa de la ultraestructura intestinal en C. elegans envejecido pero no en C. inopinata (día 14, sin aparear). Nótese la pérdida de orgánulos y sustancia fundamental. Imágenes representativas de cortes transversales TEM a través del intestino. mv, microvellosidades; au, estructura similar a un autofagosoma, L, gotitas de lípidos; G, gránulos de yema o tripa (identificación provisional). Escala 1 µm (20.000x). g Correspondencia entre gravedad de la patología y esperanza de vida. Regresión lineal de la mediana de todas las puntuaciones Z de patología (ver Fig. 2d) con esperanza de vida. El eje Y muestra la esperanza de vida media de cada especie (tratada con antibióticos). Se traza una línea de mejor ajuste para conectar los puntos de la especie Caenorhabditis; En base a esto, se traza una línea hipotética para la especie Pristionchus. Para la regresión de patologías individuales en función de la esperanza de vida, consulte la figura complementaria 2e. **** p < 0,00001.

A continuación, comparamos los patrones de patología senescente en los tres pares de especies hermanas de Caenorhabditis utilizando microscopía de Nomarski y microscopía electrónica de transmisión. Las patologías senescentes tempranas y graves en los hermafroditas adultos de C. elegans incluyen tumores uterinos prominentes, atrofia y fragmentación gonadal, deterioro faríngeo, así como atrofia intestinal junto con acumulación de yema7,8,9,23,24,25. Las patologías senescentes observadas en C. elegans también se observaron en las otras dos especies hermafroditas de Caenorhabditis, pero estuvieron en gran medida ausentes en las hembras, y esto también se cumplió en el par de especies hermanas de Pristionchus (Fig. 2c-e). Se observó una sorprendente degeneración de la ultraestructura intestinal en hermafroditas de Caenorhabditis más antiguos, lo que coincide con observaciones anteriores de C. elegans7,26 y C. briggsae27, incluidos autofagosomas prominentes (Fig. 2f; Fig. complementaria 3). Estos cambios no se observaron en las mujeres. Por lo tanto, las hembras viven más y están libres de los principales cambios anatómicos característicos de los hermafroditas senescentes.

La gravedad de la patología senescente temprana en hermafroditas varió entre especies, con la clasificación C. elegans > C. tropicalis > C. briggsae (Fig. 2c, d), y la longevidad hermafrodita mostró la clasificación inversa (Tabla complementaria 1). La variación gradual del nivel de patología con la esperanza de vida es consistente con la posible existencia de un continuo entre la presencia y la ausencia de muerte reproductiva (es decir, entre semelparidad e iteroparidad; ver más abajo) (Fig. 2g). Esto podría implicar que C. elegans y C. briggsae representan etapas tardías y tempranas, respectivamente, en la evolución de la muerte reproductiva constitutiva. En particular, el tiempo estimado desde el origen de la autofecundación en los hermafroditas es mayor para C. elegans (0,35 a 7,2 millones de años) que para C. briggsae (0,2 a 3,5 millones de años). Además, C. briggsae/C. nigoni el apareamiento entre especies puede producir descendencia28, lo que es consistente con una divergencia relativamente reciente de estas dos especies a partir de un ancestro común.

Las comparaciones anteriores se realizaron utilizando animales no apareados, lo que significa que los hermafroditas produjeron progenie pero las hembras no. Por lo tanto, las diferencias observadas podrían en principio reflejar la presencia/ausencia de producción de progenie, aunque cabe señalar que la prevención de la producción de autoprogenie per se no afecta la esperanza de vida en C. elegans3,4,29. Para investigar esta posibilidad, comparamos la esperanza de vida y la patología senescente en animales apareados de diferentes especies. El apareamiento (incluida la exposición a feromonas masculinas y la cópula) acortó la vida útil en la mayoría de las especies, como se observó anteriormente en C. elegans30,31, y anuló la mayor longevidad de las hembras (Fig. 3a; Fig. complementaria 5a, b). El apareamiento también indujo atrofia intestinal en las hembras y la mejoró en los hermafroditas, y los animales apareados de las seis especies mostraron niveles similares de atrofia intestinal (Figs. 2c; 3b, c). También se observó un efecto comparable del apareamiento en una variedad de otras patologías, donde se observaron niveles similares de deterioro en hembras apareadas y hermafroditas, como lo muestra el análisis de conglomerados de la gravedad de la patología cuantificada, y las especies de Pristionchus mostraron la misma tendencia (Fig. 2d). .

a El apareamiento en las hembras reduce significativamente la esperanza de vida, como se demostró anteriormente para C. elegans30,31,41. Media ± DE de 2 ensayos. Rango logarítmico entre animales apareados y no apareados. Para obtener detalles estadísticos, consulte la Tabla complementaria 2 y, para obtener datos sin procesar sobre la vida útil, consulte el Archivo de datos de origen. b Corte transversal representativo de TEM que muestra una reducción en el tamaño intestinal en C. inopinata tras el apareamiento. Escala de 5 μm (5000x). c Imágenes TEM representativas de gran aumento que muestran cambios ultraestructurales degenerativos en el intestino en C. inopinata tras el apareamiento, con pérdida de la estructura fundamental similar a la de C. elegans no apareada, y en contraste con la de C. inopinata no apareada, observada (cf. Fig. 2f). Escala 1 μm (20.000x). d Ningún efecto del propio esperma sobre la patología senescente en Caenorhabditis hermafroditas en la mayoría de los casos. La principal excepción son los tumores uterinos que aparecen antes debido a la aparición más temprana de ovocitos no fertilizados en el útero, pero luego se desarrollan más lentamente, como se describió anteriormente para C. elegans24. Asimismo, en C. tropicalis se observa un ligero aumento de la atrofia intestinal. Los ensayos se realizaron a 25 °C porque el ARNi inducía esterilidad en C. tropicalis a esta temperatura. Media ± sem de 3 ensayos (n = 5–10 por punto temporal en cada ensayo). Modelo de enlace acumulativo con función de enlace gamma para degeneración faríngea, degeneración gonadal y tumores uterinos que se puntúan ordinales. ANCOVA unidireccional con puntuación normalizada a d1 para determinar el cambio en el porcentaje de masa intestinal y ANCOVA unidireccional sin normalización para los depósitos de yema. Los términos del ensayo no fueron estadísticamente significativos en todas las patologías y, por lo tanto, el ensayo no se consideró una variable adicional. Para obtener detalles sobre las pruebas estadísticas, consulte la sección de métodos. e La presencia de espermatozoides propios reduce débilmente la esperanza de vida en algunos contextos. Ensayos realizados a 25 °C (ver d) y con carbenicilina incluida para evitar posibles efectos de confusión de las diferencias entre especies en la susceptibilidad a la infección bacteriana. En estudios previos de C. elegans fog-2(q71), se encontró que las hembras vivían mucho tiempo en un caso (25 °C, E. coli viva)19 y cortas en otro (20 °C, E. coli viva)20 ; el motivo de la discrepancia no está claro. Datos combinados de 3 ensayos. Prueba estadística (log-rank), comparación con hembras de tipo salvaje: estrellas azules; comparación con los hermafroditas de tipo salvaje: estrellas rojas. Para ver las curvas de supervivencia de todos los ensayos, consulte la figura complementaria 5c, para obtener detalles estadísticos, consulte la tabla complementaria 3 y, para obtener datos sin procesar sobre la esperanza de vida, consulte el archivo de datos fuente. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,0001, **** p < 0,00001.

Estos hallazgos podrían implicar que la muerte reproductiva es inducida por el apareamiento en las hembras. Esto proporcionaría una posible explicación de cómo estos patrones similares de patogénesis evolucionaron de forma independiente en las tres especies androdioicas: como consecuencia de un cambio de la muerte reproductiva inducida por el apareamiento en las hembras a la muerte reproductiva constitutiva en los hermafroditas, independientemente de que (en estos últimos) Se ha producido la reproducción por autofecundación. Si el apareamiento induce la muerte reproductiva en las hembras, uno podría esperar que también induzca la salida de la yema: críticamente, para que ocurra la muerte reproductiva, de acuerdo con la semelparidad, debe implicar algún tipo de beneficio de aptitud física. Sin embargo, solo se detectaron niveles muy bajos de yema ventilada en hembras apareadas (Figura complementaria 1a). En C. elegans, el apareamiento redujo los niveles de yema ventilada, como sucedió en todas las especies hermafroditas, probablemente debido a una mayor absorción de yema en los ovocitos que posteriormente son fertilizados. Estos resultados podrían implicar que en las hembras la muerte reproductiva está asociada a la producción de yema únicamente para el aprovisionamiento de huevos, pero la existencia de tal beneficio aún no se ha demostrado; por lo tanto, no está claro si la patología inducida por el apareamiento en las hembras se combina con un beneficio reproductivo, es decir, si las hembras apareadas presentan muerte reproductiva.

Según este modelo, la evolución de la muerte reproductiva en hermafroditas requiere la activación constitutiva de procesos que normalmente requieren que se induzca el apareamiento. La evolución del hermafroditismo en C. elegans probablemente comenzó cuando las hembras desarrollaron la capacidad de generar y activar espermatozoides propios32. Una posibilidad es que la aparición de espermatozoides propios fuera suficiente para que la muerte reproductiva se volviera constitutiva. Para investigar esto, probamos si anular la producción de esperma propio en los hermafroditas de Caenorhabditis suprimiría la patología senescente y extendería la esperanza de vida. Las intervenciones utilizadas fueron fog-2(q71) y fem-3(e2006) en C. elegans33,34, she-1(v35) y she-1(v49) en C. briggsae35, y ARNi de un ortólogo putativo de fem-3. (Csp11.Scaffold629.g10847, Ctr-fem-3) en C. tropicalis.

El bloqueo de la producción de esperma propio no suprimió el desarrollo de la patología senescente (Fig. 3d). Sin embargo, sí aumentó la esperanza de vida en varios casos: en C. elegans con fog-2 pero no con fem-3, lo que coincide en ambos casos con hallazgos anteriores4,19, y en C. briggsae con she-1, pero en ningún caso hasta el mismo nivel. grado de longevidad femenina de las especies hermanas (Fig. 3e). En C. tropicalis Ctr-fem-3 RNAi redujo fuertemente la vida útil, lo que posiblemente refleja efectos pleiotrópicos. Estos resultados implican que la muerte reproductiva constitutiva no es una simple consecuencia de la evolución de la autofecundación. Sin embargo, dejan abierta la posibilidad de que la aparición de espermatozoides propios contribuya a un proceso evolutivo de varios pasos. La posibilidad de que la muerte reproductiva en hermafroditas autofertilizantes sea una consecuencia de la reproducción misma fue descartada por la observación temprana de que los hermafroditas estériles (por ejemplo, debido a espermatozoides defectuosos en la fertilización) no son longevos3,29. Por lo tanto, si bien la reproducción per se no acorta la esperanza de vida, la presencia de espermatozoides propios sí podría hacerlo hasta cierto punto.

En especies semélparas donde la muerte reproductiva se desencadena con la madurez reproductiva, adelantarse a la reproducción puede aumentar considerablemente la esperanza de vida1,2. Por ejemplo, la eliminación de las flores antes de la polinización puede aumentar la vida útil de la soja de 119 a 179 días36, y la gonadectomía del salmón del Pacífico antes del desove puede aumentar la vida útil máxima de 4 años a hasta 8 años15. De manera similar, la prevención del desarrollo de la línea germinal en C. elegans hermafroditas aumenta en gran medida la esperanza de vida5 y suprime la atrofia intestinal9.

Una posibilidad es que la ablación de la línea germinal extienda la vida útil de C. elegans al suprimir la muerte reproductiva. Dada la ausencia de una supuesta muerte reproductiva en hembras no apareadas de Caenorhabditis y Pristionchus, esto predice que la ablación de la línea germinal aumentará la esperanza de vida más en los hermafroditas que en las hembras, y este resultó ser el caso. La ablación de la línea germinal mediante microcirugía láser5 suprimió patologías importantes (Fig. 4a, b) y causó grandes aumentos en la esperanza de vida en los hermafroditas, pero solo aumentos marginales en la esperanza de vida en las mujeres (Fig. 4c). La ablación de toda la gónada de C. elegans no suprime la atrofia intestinal (Figura complementaria 6c). Esto implica que los efectos de la ablación de la línea germinal sobre la patología senescente requieren la presencia de la gónada somática, como es el caso de los efectos sobre la esperanza de vida5. Esto sugiere que la muerte reproductiva es suprimida por señales de la gónada somática; En particular, los efectos de las gónadas somáticas que prolongan la vida implican la señalización al receptor de la hormona esteroide DAF-125,37.

a La ablación de la línea germinal suprime fuertemente la progresión de la patología en hermafroditas (ver Fig. 2d; n = 5–10 por punto de tiempo). Para mediciones de patología completas, consulte la Fig. 6a complementaria, y para la progresión de la patología en mutantes con deficiencia de línea germinal, consulte la Fig. 6b complementaria. b Imágenes representativas de microscopía de Nomarski tomadas con el fin de calificar patologías. c La ablación de la línea germinal aumenta considerablemente la esperanza de vida en los hermafroditas, pero no en las especies de nematodos femeninos. De manera similar, bloquear la muerte reproductiva en especies semélparas aumenta considerablemente la esperanza de vida, mientras que la gonadectomía en especies iteróparas en general no lo hace. Para las especies Caenorhabditis y Pristionchus, se muestra la media ± sem de 3 ensayos (estrellas, prueba de rango logarítmico para animales sometidos a ablación versus animales de control, y prueba de riesgo proporcional de Cox para comparar el efecto en hermafroditas versus hembras). Los valores para otras especies se han tomado de una revisión reciente2; para múltiples estudios de la misma especie, solo se incluyen referencias con datos de machos y hembras, y para A. anguila (anguila) datos de la fuente más reciente78. Para obtener datos sobre patología después de la ablación de toda la gónada, consulte la figura complementaria 6c. Para ensayos individuales, detalles sobre estadísticas y datos brutos de vida útil, consulte la Figura complementaria 7, la Tabla complementaria 4 y el Archivo de datos de origen, respectivamente. * p < 0,05, ** p < 0,01, **** p < 0,00001.

También examinamos informes publicados que han evaluado los efectos sobre la esperanza de vida de la gonadectomía o, para algunas especies semélparas, la prevención de la muerte reproductiva por otros medios. Esto confirmó que grandes aumentos en la esperanza de vida son típicos de organismos semélparos pero no iteróparos (Fig. 3c). La esperanza de vida de los hermafroditas y las hembras de los animales con ablación de la línea germinal en cada par de especies hermanas fue similar (Figura complementaria 7), lo que respalda la hipótesis de que la esperanza de vida más corta de los hermafroditas es atribuible a la muerte reproductiva.

Los resultados presentados en este estudio, junto con hallazgos anteriores, muestran que una serie de propiedades de C. elegans se ajustan a los criterios utilizados para definir la muerte reproductiva en especies semélparas, es decir, respaldan la hipótesis de que exhibe muerte reproductiva. Los hermafroditas de C. elegans exhiben cambios anatómicos importantes de naturaleza claramente patológica (degeneración, tumores) en órganos vinculados a la reproducción relativamente temprano en la edad adulta, algunos de los cuales resultan de la reutilización de la biomasa para la producción de yema2,9,14,38, mientras que nada de esto es visto en hembras no apareadas. Los hermafroditas viven menos que las hembras de sus especies hermanas, pero no después de la eliminación de la línea germinal, lo que provoca grandes aumentos en la esperanza de vida sólo en los hermafroditas. Esto es consistente con la hipótesis de que la eliminación de la línea germinal, como la gonadectomía en el salmón del Pacífico, aumenta la esperanza de vida al prevenir la muerte reproductiva.

En consonancia con esto, los machos de C. elegans se parecen a las hembras de Caenorhabditis en que no presentan patologías degenerativas importantes como atrofia intestinal y desintegración de las gónadas9,23, y la eliminación de la línea germinal en machos de C. elegans de tipo salvaje tiene poco efecto sobre la esperanza de vida39. Además, la prevención de la madurez reproductiva mediante gonadectomía u otros medios normalmente causa grandes aumentos en la esperanza de vida en organismos semelparos pero no en organismos iteróparos2,38 (Fig. 4c).

Un rasgo característico de los organismos semélparos que presentan muerte reproductiva es que su esperanza de vida después de la reproducción es muy corta. Mientras que en términos relativos (es decir, como proporción de su esperanza de vida total), los hermafroditas autofecundados tienen una vida post-reproductiva larga, en términos absolutos esta duración es muy corta (~2 semanas, en condiciones de cultivo estándar). Además, los hermafroditas con escasez de espermatozoides no son necesariamente post-reproductivos dada la ocurrencia de ventilación de la yema14.

El apareamiento con machos induce cambios patológicos en las hembras similares a los observados en hermafroditas no fertilizados (Figs. 2c, d; 3b, c), lo que sugiere la posibilidad de que la muerte reproductiva también ocurra en las hembras apareadas. Sin embargo, mientras que en los hermafroditas hay evidencia de que la degeneración intestinal se combina con la producción de yema ventilada en un equilibrio de aptitud9,14, actualmente falta evidencia de un equilibrio similar en las hembras apareadas; el apareamiento no induce la ventilación de la yema (Figura complementaria 1). Un posible candidato para tal beneficio es una mayor producción de yema para el aprovisionamiento de ovocitos.

El hecho de que tanto el líquido seminal31 como las feromonas masculinas40,41 promuevan los efectos acortadores de la vida de la exposición a los hombres se ha interpretado como indicativo de conflicto sexual42. Otra posibilidad es que los efectos de acortamiento de la vida de los machos sobre las hembras/hermafroditas sean un costo vinculado a un aumento mutuamente beneficioso de la aptitud que surge de la muerte reproductiva. Estas dos posibilidades no son mutuamente excluyentes; en particular, la presencia de esperma propio protege contra los efectos acortadores de la vida de la exposición masculina43,44, lo que es consistente con el conflicto sexual. Este mecanismo de protección está mediado por varios componentes de señalización, incluido el factor de transcripción CEH-18, el receptor de efrina VAB-143, péptidos similares a la insulina y la vía mTOR-TFEB44.

La aparición de muerte reproductiva (es decir, semelparidad) en C. elegans tendría profundas implicaciones tanto en términos de comprensión de la biología del envejecimiento como de lo que se puede aprender de C. elegans como modelo para el envejecimiento en general. Anteriormente se propuso que algunas patologías senescentes son el resultado de un cuasiprograma vitelogénico45,46, es decir, una continuación inútil de un programa de producción de yema después de la reproducción7,9,13. Si bien esto todavía es posible, si la producción posterior de yema proporciona un beneficio de aptitud física, entonces dichas patologías senescentes representarían costos reproductivos. Dichos beneficios podrían derivarse de la alimentación de la yema por parte de las larvas, ya sea cuando eclosionan dentro de la madre o cuando las larvas externas consumen la yema ventilada (lo que indica un costo de “lactancia”)14. Sin embargo, no se han identificado (aún) los procesos que promueven la aptitud física a los que se acopla la formación de tumores uterinos; por tanto, al igual que los teratomas de ovario a los que se parecen24, los tumores uterinos parecen ser el resultado de cuasiprogramas. Por lo tanto, es probable que tanto programas46 costosos como cuasiprogramas estén operativos en la senescencia hermafrodita de C. elegans.

Como se especifica en la introducción, la palabra semélparo tiene dos significados superpuestos: (i) tener un solo episodio de reproducción y (ii) reproducirse una vez seguido de muerte reproductiva. Respecto al primer sentido: podría decirse que la distinción entre semelparidad e iteroparidad puede ser difícil de aplicar a organismos con una esperanza de vida muy corta, como las especies de Caenorhabditis47. Sin embargo, el muy breve período reproductivo de C. elegans combinado con la evidencia de muerte reproductiva presentada aquí es evidencia de semelparidad en el segundo sentido de la palabra y, por extensión, en el primero.

Lo más interesante del descubrimiento de intervenciones que produjeron grandes aumentos en la esperanza de vida en C. elegans fue la existencia implícita de mecanismos con poderosos efectos sobre el envejecimiento en su conjunto. Combinado con la creencia de que la tasa de envejecimiento es una función del mantenimiento somático48, esto sugirió que podría existir una plasticidad similar en los humanos, afectando todo el proceso de envejecimiento, y proporcionando un posible objetivo para futuras intervenciones para desacelerar en gran medida el envejecimiento. Aquí presentamos evidencia de que la esperanza de vida en C. elegans está limitada por la muerte reproductiva. También hemos argumentado en otro lugar que la muerte reproductiva permite la evolución del raro fenómeno de la muerte adaptativa programada, que acorta aún más la esperanza de vida, y que esto puede haber ocurrido en C. elegans49,50,51. La supresión de tales etiologías programáticas del envejecimiento proporciona una posible explicación para la magnitud inusualmente grande de los aumentos en la esperanza de vida observados en C. elegans. Esto plantea la posibilidad de que en los organismos iteróparos no exista ningún mecanismo central similar de envejecimiento en su conjunto que sea susceptible de manipulación para producir una desaceleración dramática del envejecimiento. Lamentablemente, nuestros hallazgos podrían, en ciertos aspectos, explicar la mística de la plasticidad de la vida útil de C. elegans.

¿La ocurrencia de muerte reproductiva significaría que C. elegans muere por mecanismos no relacionados con los que operan en la mayoría de los demás organismos? Creemos que no. En el pasado, se hacía una clara distinción entre el envejecimiento verdadero, causado por la acumulación de daño estocástico, y el envejecimiento programado como se observa en las plantas (por ejemplo, senescencia de las hojas) y en especies semélparas como el salmón del Pacífico1,2. Sin embargo, se ha reconocido que los reguladores conservados evolutivamente de la plasticidad fenotípica en el envejecimiento, como la insulina/IGF-1 y las vías mecanicistas de la rapamicina (mTOR), pueden actuar a través de mecanismos programáticos para promover la patología senescente45,52,53,54. La inhibición de estas vías puede provocar grandes aumentos en la esperanza de vida de C. elegans, pero también efectos más pequeños en animales superiores; por ejemplo, la mutación de la fosfatidilinositol 3-quinasa puede aumentar la esperanza de vida media hasta ~10 veces en C. elegans, pero sólo ~1,07 veces y ~1,02 veces en Drosophila y ratón, respectivamente6,55,56.

Dada la conservación evolutiva del papel de estas vías en el envejecimiento, sugerimos que los mecanismos de muerte reproductiva evolucionan reutilizando mecanismos programáticos que afectan el envejecimiento en pequeña medida en organismos iteróparos2,38. Se ha argumentado que las historias de vida de semélparos e iteróparos no son fenómenos aislados sino que representan un continuo57. Esto respalda el gradiente observado entre la presencia y ausencia de supuesta muerte reproductiva en especies de nematodos y en C. elegans en intervenciones que suprimen patologías de muerte reproductiva y extienden la vida útil, incluida la ablación de la línea germinal y la reducción del IIS (Fig. 5). Por lo tanto, incluso si C. elegans sufre muerte reproductiva, sigue siendo un buen modelo para comprender los mecanismos programáticos del envejecimiento que contribuyen a la multimorbilidad senescente que son universales en los organismos metazoarios46.

Correlación entre patologías asociadas a muerte reproductiva y esperanza de vida en diferentes especies y después de diferentes tratamientos en C. elegans, apoyando la presencia de un continuo de semelparidad-iteroparidad. Eje X, puntuación Z de patología mediana. Eje Y: esperanza de vida media (no apareados, tratados con antibióticos). Otras fuentes de datos: patología del ARNi y esperanza de vida13; esperanza de vida de los mutantes79. Para mediciones de patología mutante, consulte la figura complementaria 8.

No se utilizaron métodos estadísticos para predeterminar el tamaño de la muestra. Los experimentos no fueron aleatorios. Los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos y la evaluación de resultados a menos que se indicara lo contrario. Todas las pruebas estadísticas se realizaron con datos sin procesar utilizando GraphPad Prism 8.0, a menos que se indique lo contrario.

El mantenimiento de C. elegans y otras especies se realizó utilizando protocolos estándar58. A menos que se indique lo contrario, todas las cepas y especies se cultivaron a 20 °C en medios de crecimiento de nematodos (NGM) con placas sembradas con E. coli OP50 para proporcionar una fuente de alimento. Para C. elegans, se utilizó como tipo salvaje (N2H) una cepa hermafrodita N2 obtenida recientemente del Centro de Genética Caenorhabditis (ref. 59). Los genotipos de las cepas mutantes de C. elegans utilizadas se describen en Wormbase (www.wormbase.org) e incluyen CB3844 fem-3(e2006), CB4037 glp-1(e2141), GA14 fog-2(q71), GA114 daf-16. (mgDf50); daf-2(e1370), GA1928 daf-2(e1370), GR1307 daf-16(mgDf50) y SS104 glp-4(bn2). A menos que se indique lo contrario, las cepas de otras especies de nematodos fueron VT847 C. briggsae, NK74SC C. inopinata, JU1325 C. nigoni, JU1373 C. tropicalis, JU1873 C. wallacei, RS5522 P. exspectatus y RS2333 P. pacificus. También se utilizaron los mutantes femeninos de C. briggsae RE665 she-1 (v35) y RE770 she-1 (v49), y se compararon con C. briggsae (AF16) del que se derivan estos mutantes35. C. inopinata se criaron a 25 °C hasta la etapa L4 y luego se transfirieron a 20 °C ya que a esta última temperatura exhiben una tasa de desarrollo muy lenta21. Los mutantes sensibles a la temperatura (glp-1, glp-4, she-1) y los controles que los acompañaban se elevaron a 15 °C hasta la etapa L4 y luego se cambiaron a 25 °C, la temperatura no permisiva.

La identificación de los ortólogos de C. tropicalis de C. elegans fog-2 y fem-3 se realizó utilizando Wormbase ParaSite60,61. Tras la alineación de la secuencia de proteínas y ADN62, C. tropicalis Csp11.Scaffold629.g10847 fue designado como ortólogo de C. elegans fem-3. No se encontró ningún ortólogo de C. elegans fog-2 en C. tropicalis, lo que es consistente con diferencias en la regulación de la función de los espermatozoides en estas dos especies63. Se diseñaron tres regiones objetivo de ARNi para mejorar la eficiencia de la eliminación. Para sintetizar dsRNA para microinyección, se generaron tres productos de PCR para transcripción in vitro con cebadores específicos con secuencias promotoras de T7 (TAATACGACTCACTATAGGG) incluidas en los extremos 5'. Las condiciones del ciclo de PCR fueron 95 °C 30 s, 47 °C 30 s, 72 °C 60 s durante 30 ciclos. Los productos de PCR se purificaron mediante extracción en gel utilizando un kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN). Los dsRNA se sintetizaron in vitro utilizando un kit de transcripción MAXIscript T7 (ThermoFisher), y esto fue seguido por electroforesis en gel de ARN para analizar el tamaño y la calidad del producto. A continuación, los tres dsRNA se mezclaron en una proporción de 1:1:1, a una concentración final de 0,1 μg/μl, y luego se inyectaron en ambos brazos de la gónada de un C. tropicalis adulto de 1 día de edad64. Los nematodos inyectados se recuperaron y se les permitió poner huevos durante 6 horas a 25 °C para obtener una progenie sincronizada en el desarrollo. Luego se transfirieron individualmente a pocillos de una placa de 24 pocillos con NGM sembrado con OP50 y se cultivaron hasta la edad adulta. Aproximadamente el 50% resultó ser estéril y, por lo demás, de tamaño y apariencia normales y se utilizaron para ensayos experimentales. Se utilizó como control negativo la progenie de hermafroditas de C. tropicalis no inyectados. Consulte también la figura complementaria 9 y las tablas complementarias 5 a 7.

Los nematodos vivos se colocaron sobre almohadillas de agar al 2% y se anestesiaron con una gota de levamisol al 0,2%. Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio Zeiss Axioskop 2 plus con una cámara digital Hamamatsu ORCA-ER C4742-95 y el software Velocity 6.3 (versión Macintosh) para la adquisición de imágenes; o un microscopio ApoTome.2 Zeiss con cámara digital Hamamatsu C13440 ORCA-Flash4.0 V3 y software Zen. El brillo y el contraste se ajustaron por igual en toda la imagen y, cuando correspondía, se aplicaron por igual a los controles.

La preparación de muestras de nematodos se basó en el protocolo estándar65 (protocolo 8). Brevemente, los animales se lavaron dos veces en tampón M9, se colocaron en una solución fijadora (glutaraldehído al 2,5 %, paraformaldehído al 1 % en sacarosa 0,1 M, cacodilato 0,05 M) y, para aumentar la penetración del colorante, se cortaron por debajo de la faringe para retirar las cabezas usando un cortador de 30 G aguja hipodérmica. Luego se enjuagaron 3 veces en cacodilato 0,2 M, se fijaron en OsO4 al 0,5% y KFe(CN)6 al 0,5% en cacodilato 0,1 M sobre hielo y se lavaron secuencialmente en cacodilato 0,1 M y acetato de sodio 0,1 M. Luego se tiñeron los nematodos en acetato de uranilo al 1% en acetato de sodio 0,1 M (pH 5,2) durante 60 minutos, se enjuagaron 3 veces en acetato de sodio 0,1 M y luego se enjuagaron durante la noche en agua Milli-Q. Luego, las muestras se incluyeron en agarosa seaplaque al 3%, se deshidrataron y se infiltraron usando series de etanol y resina de propileno y luego se curaron a 60 °C durante 3 días.

Se tomaron secciones seriadas de 1 μm para microscopía óptica y, desde una región posterior al útero posterior, se cortaron secciones ultrafinas (70–80 nm) utilizando un cuchillo de diamante en un ultramicrotomo Reichert. Se tomaron imágenes comparativas de bajo aumento que muestran mitades de pares de especies hermanas de nematodos de aproximadamente la misma región de los animales que contienen el intestino posterior. Las secciones se recolectaron en rejillas de ranura de 2 × 1 mm recubiertas con formvar que permitieron tomar imágenes de bajo aumento sin barras de rejilla y teñirlas con citrato de plomo antes de verlas y tomar imágenes en un microscopio electrónico de transmisión Joel 1010. Las imágenes se grabaron utilizando una cámara CCD Gatan Orius y se obtuvieron utilizando el software de imágenes Gatan. El brillo y el contraste se ajustaron por igual en toda la imagen y, cuando correspondía, se aplicaron por igual a los controles.

Los animales se mantuvieron a una densidad de 25 a 30 por placa desde la etapa de huevo para minimizar los efectos asociados a la densidad de población sobre el envejecimiento que ocurren en C. elegans66, y sin la adición de FUDR. Se puntuaron las cohortes de nematodos cada 2 a 3 días para determinar los muertos, y todos los animales se transfirieron diariamente durante el período reproductivo y, a partir de entonces, cada 6 a 7 días. Los gusanos se clasificaron como vivos si eran móviles o respondían al tacto suave con un palillo de platino. Para los ensayos de supervivencia en bacterias irradiadas con luz ultravioleta, se agregaron 80 µl de E. coli OP50 a cada placa de NGM y se dejaron durante la noche a 20 °C. Luego las placas se expusieron a UV durante 30 minutos en un horno UV Stratalinker. Los nematodos se criaron a partir de bacterias tratadas con rayos UV a partir de huevos asépticos. Los datos brutos de mortalidad de todos los ensayos se proporcionan en tablas de Ziehm67 en el archivo de datos fuente para permitir un escrutinio minucioso de los datos (incluido un nuevo análisis futuro). Los gráficos de supervivencia muestran datos combinados de vida útil y ensayos individuales, tomando la etapa de desarrollo L4 como el día 0. Los animales que desaparecieron de la placa, murieron accidentalmente durante el manejo, murieron debido a la desecación en la pared de la placa de Petri, se rompieron la vulva o murieron. debido a la eclosión interna de las larvas se registraron como censuradas. Los valores censurados se tuvieron en cuenta en el análisis estadístico. Las pruebas para diferencias estadísticamente significativas entre la supervivencia de cohortes emplearon la prueba de rangos logarítmicos, y para diferencias significativas en la magnitud de los efectos de dos tratamientos, el análisis de riesgos proporcionales de Cox, en ambos casos realizado con el software JMP, versión 14.0 (SAS Institute, Inc. ).

Las larvas L4 se mantuvieron individualmente en placas NGM de 35 mm con céspedes de E. coli OP50 (n = 10 por ensayo) y se transfirieron cada 24 horas hasta que cesó la producción de ovocitos no fertilizados, con un mínimo de 12 días anotados para todos los gusanos. Para marcar, la placa de Petri abierta se colocó sobre una placa invertida que tenía una cuadrícula de líneas paralelas, lo que permitió marcar la placa de manera eficiente con una serie de barridos verticales. Cuando se observaron grupos de ovocitos, estos se separaron cuidadosamente utilizando un recogedor de lombrices para contar los ovocitos individuales. P. pacificus y P. exspecttatus también pusieron algunos huevos muertos, lo que coincide con observaciones anteriores (RJ Sommer, comunicación personal), que fueron descartadas.

La cuantificación de la proteína de la yema ventilada se realizó como se describió anteriormente14. Brevemente, se mantuvieron entre 100 y 200 larvas L4 en placas de 35 mm con césped de E. coli OP50 y se transfirieron diariamente a placas nuevas. Después de la transferencia, la yema ventilada se lavó con 1 ml de M9 que contenía NP-40 al 0,001% para solubilizar la vitelogenina, como se describe68, y 2 μg/ml de BSA como estándar externo. Luego se centrifugó para separar las fracciones antes de la liofilización. Después de la liofilización, la yema se resuspendió en una solución compuesta por 30 µl de solución de SDS al 4%, pH 9, 10 µl de DTT, 1 ml de Tris HCL 1 M, pH 8, 10 µl de EDTA 0,5 M, 5 ml de agua Milli-Q y 12 mg de bromofenol. azul.

La cuantificación de la yema interna (sin ventilación) utilizó un protocolo similar al descrito anteriormente13. Brevemente, se transfirieron 10 animales por condición por tratamiento a placas NGM que carecían de bacterias y se les permitió gatear durante 30 a 60 s para eliminar las bacterias de la superficie del nematodo. Luego se transfirieron a 25 µl de M9 y se congelaron inmediatamente a -80 °C hasta su uso.

Las muestras se mezclaron con 25 µl de tampón de muestra 2X Laemmli (Sigma-Aldrich), se incubaron a 70 °C y se agitaron periódicamente durante 15 minutos, y luego se incubaron a 95 °C durante 5 minutos y se centrifugaron a 6000 rpm durante 15 minutos. Para todas las muestras, se realizó electroforesis en gel de dodecilsulfato de sodio-poliacrilamida (SDS-PAGE), utilizando Criterion XT Precast Gels 4–12% Bis-Tris (Invitrogen) y XT MOPS (Invitrogen) como tampón de ejecución (relación 7:1). con agua Milli-Q) a 90 V. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie coloidal como se describe69, usando 5% de sulfato de aluminio (14-18)-hidrato y 2% de ácido ortofosfórico (85%) para crear partículas coloidales. Los geles se analizaron utilizando ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare). La identificación de las bandas de proteínas se basó en datos publicados70. Dentro de los carriles, los YP ventilados se normalizaron con respecto al BSA que se había agregado durante la recolección de muestras como estándar externo. Para las muestras de YP internos, las bandas de YP se normalizaron con respecto a la miosina como estándar para tener en cuenta la pérdida de proteínas durante la carga del gel, así como para permitir la normalización del tamaño de los nematodos al comparar diferentes especies.

Se capturaron imágenes de microscopía Nomarski de patologías senescentes en cohortes de gusanos (n = 5–10 por punto de tiempo por condición por ensayo) en los días 1, 4, 7, 11 y 14 y las imágenes se analizaron cuantitativamente (intestino, depósitos de yema), o semicuantitativamente y ciego (deterioro faríngeo, atrofia y fragmentación de las gónadas, tumores uterinos) por varios observadores entrenados como se describe8,9,71. En resumen, la atrofia intestinal se cuantificó midiendo el ancho intestinal en un punto entre la gónada posterior y el ano, restando el ancho de la luz intestinal y dividiéndolo por el ancho del cuerpo para obtener una estimación del ancho de la sección transversal intestinal normalizado al tamaño corporal. . La acumulación de yema se midió dividiendo el área de los charcos de yema por el área del cuerpo visible en el campo de visión con un aumento de 630x. Para el deterioro faríngeo, la atrofia y fragmentación de las gónadas y los tumores uterinos, a las imágenes se les asignaron puntuaciones de 1 a 5, donde 1 = apariencia juvenil y saludable; 2 = signos sutiles de deterioro; 3 = patología leve claramente discernible; 4 = patología bien desarrollada; y 5 = tejido tan deteriorado que es apenas reconocible (p. ej., gónada completamente desintegrada), o alcanza un nivel máximo (p. ej., un tumor grande que ocupa todo el ancho del cuerpo).

La puntuación se adaptó a las diferentes especies de nematodos de la siguiente manera. La puntuación de la senescencia faríngea en las especies de Pristionchus tuvo en cuenta la ausencia normal de un triturador72. Para calificar la senescencia gonadal, los criterios para una gónada sana incluían si los dos brazos de la gónada se tocan entre sí (lo que ocurre en los adultos jóvenes). Los animales en los que los brazos de las gónadas no se tocan o que muestran un estrechamiento en los brazos de las gónadas recibieron una puntuación de 2, ambas características una puntuación de 3 y, además, la fragmentación de los brazos de las gónadas una puntuación de 4. Para la puntuación de tumores uterinos en hembras jóvenes no apareadas un útero vacío y sin óvulos, se le dio una puntuación de 1.

Para preparar los datos para el modelado, los datos se preprocesaron por las siguientes razones. El nivel máximo de patología para C. elegans y la mayoría de los animales apareados (que muestra una tasa máxima de progresión de la patología) se alcanza principalmente el día 14, después del cual los niveles de patología se estabilizan. Por lo tanto, los datos de patología después del día 14 oscurecen el cálculo de los gradientes que representan la tasa inicial de progresión de la patología. Las puntuaciones del intestino para cada combinación de especies y tratamiento se normalizaron a la puntuación media del intestino respectiva el día 1. Por lo tanto, las puntuaciones de patología intestinal normalizadas representan el cambio en el porcentaje del volumen intestinal, lo que explica las diferencias en términos de la relación entre el ancho del intestino y el cuerpo entero. ancho entre especies. Para las puntuaciones del depósito vitelino no se utilizó ninguna normalización porque se midió el porcentaje de la cavidad corporal que contenía depósitos vitelino. Las mezclas de yema se analizaron como puntuación + 1, para garantizar que todos los datos fueran positivos (un requisito para la regresión Gamma). Se aplicaron modelos lineales generalizados (GLM) a los datos para probar el efecto de las especies, el tratamiento y el ensayo sobre la progresión de la patología. También se incluyeron términos de interacción entre estas variables. Se aplicaron sistemáticamente diferentes familias de modelos y funciones de enlace a cada conjunto de datos de patología según el tipo de datos registrados. Para las variables continuas positivas (grupos de intestino y yema), las puntuaciones de patología se modelaron como variables distribuidas gaussianas y gamma. Para las variables ordinales (tumor, gónada y faringe), se aplicaron modelos de enlace acumulativo a los datos utilizando el paquete ordinal en R (ref. 73).

Se seleccionaron los siguientes modelos para cada patología basándose en la minimización del Criterio de información de Akaine (AIC), lo que significa que estos modelos explicaron la mayor varianza en la progresión de la patología utilizando la menor cantidad de términos: (i) intestino: variable de respuesta distribuida gaussiana con enlace inverso función; (ii) pools de yema: variable de respuesta distribuida gamma con función de enlace de identidad; y (iii) tumor, gónada y faringe: variable de respuesta distribuida ordinal con función de enlace log-gamma. La gran mayoría de los términos del ensayo no fueron estadísticamente significativos en todas las patologías, lo que indica que las diferencias en la progresión de la patología fueron reproducibles y sólidas. Por lo tanto, el ensayo no se consideró más como variable. Para comparar si las diferencias en la progresión de la patología entre combinaciones de especies y tratamientos fueron estadísticamente significativas, se aplicaron pruebas t explícitamente a las comparaciones de interés utilizando el paquete multcomp en R (ref. 74).

Para todas las imágenes de muestra mostradas, los experimentos se repitieron un mínimo de tres veces de forma independiente y se verificaron para garantizar la reproducibilidad de los resultados.

Para comparar las diferencias en la progresión de la patología entre especies y tratamientos, los gradientes de cada modelo se transformaron en puntuaciones Z (que describen la relación de un valor con la media de un grupo de valores), necesarias para comparar patologías entre sí. Las puntuaciones Z de patología se muestran y comparan como mapas de calor, utilizando diferencias euclidianas por pares para agrupar patologías y especies/tratamientos según la similitud del perfil. Para modelar el impacto de las puntuaciones Z de patología en la esperanza de vida, se realizó una regresión lineal, utilizando la puntuación Z de patología como variable independiente y la inversa de la esperanza de vida media como variable dependiente. Para evaluar el impacto combinado de todas las patologías en la esperanza de vida, se utilizó la mediana de las puntuaciones Z de patología como variable independiente. Se encontró que las puntuaciones Z para todas las patologías eran estadísticamente significativas, y se encontró que la puntuación Z de patología media funcionaba mejor que las patologías individuales.

Se montaron larvas L1 vivas en un portaobjetos de vidrio sobre una almohadilla de agar al 5% con levamisol como anestésico. La concentración de levamisol y la proporción de tampón M9/agua Milli-Q se optimizó para cada par de especies hermanas: levamisol 0,2 mM en M9 para C. elegans, C. inopinata, C. tropicalis y C. wallacei; Levamisol 0,2 mM en una proporción 1:1 de M9 a agua Milli-Q para C. briggsae y C. nigoni; y levamisol 0,1 mM en M9 para P. pacificus y P. exspecttatus. Las ablaciones se realizaron utilizando un Zeiss Axioplan 2 equipado con una unidad láser Andor MicroPoint (láser CE N2 con Ctlr/PSU/IntLk) a 440 nm y un filtro Dye Cell de 435 nm. Las células precursoras de la línea germinal (Z2 y Z3) se identificaron por morfología y posición con óptica Nomarski y se sometieron a ablación en animales L1 recién nacidos utilizando un protocolo estándar75.

Después de la ablación, las larvas se transfirieron a placas nuevas lavándolas con tampón M9 (30 µl) para todos los pares de especies excepto C. briggsae y C. nigoni que se recuperaron en una proporción 1:1 de M9 a Milli-Q. agua (total 30 μl). Luego se permitió que todos los animales sometidos a ablación se recuperaran hasta el día 1 de la edad adulta y se examinaron bajo un microscopio Nikon SMZ645 para detectar la falta de puesta de huevos, lo que indica que la ablación fue exitosa, así como la presencia de una vulva, lo que indica que Z1 y Z4. Las células estaban intactas. Para las hembras no apareadas que no ponen huevos, se comprobaron entre 15 y 20 gusanos seleccionados al azar por condición y por ensayo mediante microscopía Nomarski (aumento de ×100 con un objetivo de aire de ×10, sin anestesia) en una placa NGM para detectar la presencia de una gónada completamente desarrollada. , y no se encontró que ninguno tuviera uno. Los animales del tratamiento simulado se sometieron a las mismas manipulaciones que los animales sometidos a ablación, además de recibir disparos con el microhaz láser. La ablación de la gónada somática (eliminando las células precursoras de la gónada Z1-4) se realizó de manera similar; Se examinaron los gusanos adultos resultantes para confirmar la ausencia de vulva.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos generados en este estudio se proporcionan en el artículo y sus archivos de información complementaria. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a L. Cao, B. Evans, D. Mills, S. Mirpuri, L. Montemayor, E. Morisot, C. Nguyen Hong, S. Theivendran, Y. Wang y X. Wei por su asistencia técnica y contribuciones menores. , M. Turmaine por su ayuda con la microscopía electrónica, A. Barrios y RJ Poole por el acceso a las instalaciones de ablación láser, RE Ellis (Rowan University) por proporcionar mutantes she-1 de C. briggsae, N. Kanzaki y T. Kikuchi (FFPRI Tsukuba) por proporcionar C. inopinata, RJ Sommer (MPI Developmental Biology, Tübingen) por proporcionar especies de Pristionchus. También agradecemos a AD Cutter (Universidad de Toronto), M.-Q. Dong y C. Zhai (NIBS Beijing), D. Hall (Facultad de Medicina Albert Einstein), RJ Sommer (Tübingen), V. Rottiers (UC Berkeley) y ER Galimov, T. Niccoli, Y. de la Guardia y otros científicos en el Instituto de Envejecimiento Saludable para asesoramiento y discusión útil y/o comentarios sobre el manuscrito. Algunas cepas fueron proporcionadas por el Centro de Genética Caenorhabditis (CGC), financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de los NIH (P40 OD010440). Este trabajo fue apoyado por un premio Wellcome Trust Investigator Award (215574/Z/19/Z) para DG y un doctorado de Boehringer Ingelheim Funds. Beca a ST Este artículo está dedicado a la memoria de nuestro querido coautor StJohn Townsend, quien falleció recientemente.

Fallecido: StJohn Townsend.

Instituto de Envejecimiento Saludable y Departamento de Investigación de Genética, Evolución y Medio Ambiente, University College London, Londres, WC1E 6BT, Reino Unido

Carina C. Kern, Shivangi Srivastava, Marina Ezcurra, Kuei Ching Hsiung, Nancy Hui, StJohn Townsend, Dominik Maczik, Bruce Zhang, Victoria Tse, Viktoras Konstantellos, Jürg Bähler y David Gems

Escuela de Biociencias, Stacey Building, Universidad de Kent, Canterbury, Kent, CT2 7NJ, Reino Unido

Marina Ezcurra

Laboratorio de Biología Molecular del Metabolismo, Instituto Francis Crick, Londres, NW1 1AT, Reino Unido

San Juan Townsend

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DG supervisó el proyecto. DG y CCK concibieron el proyecto, diseñaron los experimentos y el análisis de datos y escribieron el manuscrito. CCK, ME, NH, SS, VT y BZ realizaron experimentos. ME, NH, DM y VT realizaron la captura y análisis de datos de patología. KCH realizó estudios de ARNi mediante inyección. NH ayudó con la recolección y medición de proteínas internas y ventiladas. VK realizó electroforesis en gel y analizó geles de proteínas. SS realizó y calificó la esperanza de vida. SS y NH realizaron ablaciones con láser. ST y JB realizaron e interpretaron análisis cuantitativos de patología y comparación con la esperanza de vida.

Correspondencia a David Gems.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Kern, CC, Srivastava, S., Ezcurra, M. et al. El envejecimiento de C. elegans se ve acelerado por un programa reproductivo autodestructivo. Nat Comuna 14, 4381 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40088-1

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Recibido: 15 de enero de 2021

Aceptado: 12 de julio de 2023

Publicado: 20 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40088-1

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